1937年，K．Lohmann和Ph. Schuuster从发酵粉中以氯化维生素B1焦磷酸酯的形式分离出辅羧酶。同年，Stern和Hofer利用维生素B，和三氯氧磷反应制备了氯化维生素B，焦磷酸酯[cf. Science，Vol. 85，p．483 (1937)]。1938年，文献报道了利用维生素B1与焦磷酸钠与磷酸的混合溶液反应制备硫胺蕉磷酸酯[cf. Joural  of  the AmericanChemicaISociety，Vol. 60，p．2263 (1938)]，通过利用磷钨酸溶液与大量的有机溶剂处理得到硫胺焦磷酸酯，收率10%左右。1940年，文献报道了利用维生素B1类似物5-溴化乙烯一噻唑和磷酸银反应制备了氯化维生素B1焦磷酸酯[cf. Biochemical Journal，V01. 34，p．980 (1940)]，该方法中，硫胺焦磷酸酯以银盐的形式析出，用硫化氢除去银离子，然后用氯化氢处理得到氯化硫胺焦磷酸酯。

US2991284、US5047223公开了维生素B1与磷酸和五氧化二磷混合反应制备得到辅羧酶粗品混合物并使混合物经过弱碱性离子交换树脂和阳离子交换树脂纯化得到四水合辅羧酶的方法；CN188789IA公开了一种以磷酸与五氧化二磷在加热条件下与维生素B1应得到辅羧酶粗品，粗品再分别通过弱碱性阴离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂纯化，再经结晶处理制得高纯度四水合辅羧酶（含量大于99%）的方法。